壳聚糖(chitosan)，是由甲壳素脱乙酰基得到得产物，是自然界唯一带正电的可降解天然碱性多糖，具有好的生物相容性、生物降解性等优良性能(赵易尔和金丹,2015)，被广泛用于医药、造纸、化妆品、食品和生物技术等领域(Pareek et al., 2013)。淡水小龙虾是江苏省特别是淮安地区最重要的经济水产品之一，而人们最普遍的食用方法是经烹饪后直接食用，因此的产生大量虾壳废弃物，给环境造成巨大污染，虾壳中甲壳素、壳聚糖等活性物质没有得到合理的开发利用，也造成了严重的资源浪费。小龙虾壳聚糖是以小龙虾壳废弃物为原料，提取其中甲壳素后，经脱乙酰基制得。当今，国内外研究和生产实践仍然是利用高浓度强碱脱乙酰基制备壳聚糖(季锦林等,2013; Sila et al., 2013)，近几年，国内采用超声波协助碱法、微波法等方法制备小龙虾壳聚糖的研究并不罕见，但制备原理基本上是利用强碱的作用破坏甲壳素分子间作用力，进而脱乙酰基，这些方法需要大量高浓度的碱液，一旦工业化生产，势必造成极大的环境污染，且大多制备壳聚糖方法具有制备时间较长、脱乙酰度(deacelation degree, 以下简称“D.D.”)较低、性质不稳定的缺点(窦勇和胡佩红,2014)。

为减少淡水小龙虾壳自然资源的过度浪费，以烹饪后的淡水小龙虾壳为原料，通过筛选高产甲壳素脱乙酰基酶(chitin deacetylation, 以下简称“CDA”)菌株，优化发酵条件，提取高活性的CDA，以此酶为 基础，研究壳聚糖高效环保的酶法制备方法，对实现工业化生产小龙虾壳聚糖具有较高的实际应用价值。利用乙醇对所提取的小虾壳甲壳素进行浸泡处理，以破坏甲壳素分子分子间羰基与氨基之间H键，再利用微波对甲壳素进行加热预处理，促进甲壳素 底物与CDA酶相互作用，加快酶反应速度，获得高D.D的壳聚糖。本研究旨在建立高效环保的小龙虾壳聚糖酶法制备方法，为环境清洁型的小龙虾壳聚 糖工业化生产打下基础(窦勇和胡佩红,2014)。

1 结果与分析

1.1 微波辅助 CDA 酶法制备烹饪后龙虾壳聚糖单因素试验

1.1.1 最佳微波功率为 550 W

从图1知，随着微波功率的提高，D.D.不断增大，功率在550 W后D.D. 变化不大，700 W时达到最高 值 92.13%；从黏度指标看，整体减小趋势较为明显，700 W时候黏度下降幅度最大；为获得较高D.D.、较 高黏度的壳聚糖，可见550 W为最佳微波功率。

1.1.2 最佳微波处理时间为8 min

由图2可知，随微波处理时间的延长，D.D.呈上升趋势，8 min后趋于平缓，11 min达到最大值91.88%；而黏度呈缓慢下降趋势，在8 min后黏度下降较为明显；所以，综合考虑，微波处理时间为8 min为宜。

1.1.3 最适加酶量为 10%

由图3可以看出，随着加酶量的增多，D.D.呈明显上升趋势，当加酶量达到10%后，D.D.增大不多，添加量在13%时达到最大，此时D.D.为93.17%；黏度角度来看，整体波动不大，但呈缓慢减小趋势，说明酶法催化脱乙酰，没有加剧甲壳素分子断裂，生成的壳聚糖产品结构均一。从节约成本角度来看，选择10%作为最佳加酶量。

1.1.4最佳酶解时间为3~4 h

图4显示，D.D.随着酶解时间的延长，不断升高，4 h后基本不变，此时最高D.D.为92.95；而黏度随酶解时间变化，呈下降趋势，但变化幅度不大。为提高生产效率，酶解最佳时间选择3~4 h为宜。

1.1.5最适酶解温度为50℃

由图5可知，随酶解温度的升高，D.D.曲线呈现先上升后趋平缓，酶解温度50℃时，达到最高值92.93%；而黏度随着温度的升高，也呈现下降趋势，但在50℃后，黏度下降明显。原因分析如下，温度为50℃，CDA酶活性达到最高，而温度过高可能造成部分酶失活，不利于催化甲壳素脱乙酰，造成D.D.在50℃后基本不变；温度过高也可能造成壳聚糖中糖苷键的水解加剧，造成分子链断裂，使黏度下降。

1.2正交试验确定微波辅助CDA酶法制备壳聚糖的最佳条件为微波时间6 min，加酶量10%，酶解时间3 h，酶解温度为45℃

由表1正交试验直观分析看出，CDA酶法制备烹饪后龙虾壳聚糖的最佳条件优化结果为：A1B2C2D1，即微波时间6 min，加酶量10%，酶解时间3 h，酶解温度为45℃，由极差R的大小可知，影响烹饪后龙虾壳聚糖的制备效果的主次因素分别为A> C>D>B，即微波时间＞加酶量＞酶解时间＞酶解温度， 由此可见微波时间对龙虾壳甲壳素脱乙酰基度的影响最大，说明微波对龙虾壳甲壳素的辐射作用，有利于CDA酶与底物的结合催化脱乙酰基作用，这可能与微波作用破坏甲壳素分子H键有关，有关机理需进一步研究。

1.3 正交试验验证试验

由于正交试验直观分析最佳条件为A1B2C2D1， 此组合不在L9(34 )的9组试验中，为了验证正交试验设计的预测结果可靠性，采用微波时间6 min，加酶量10%，酶解时间 3 h，酶解温度为45℃，进行3组平行试验制备壳聚糖，测得3组壳聚糖 D.D值的平均值高达 93.12%，说明该组合预测结果与实际结果相 符，具有很高的可行性和实用价值。

1.4壳聚糖红外光谱初步表征

CDA酶法制备的烹饪后小龙壳聚糖红外光谱扫描结果如图6所示。壳聚糖乙酰氨基(NH-CO)有3个典型的特征吸收峰，分别是1 650 cm-1 (酰胺Ⅰ)、1 550 cm-1 (酰胺Ⅱ)和1 310 cm-1 (酰胺Ⅲ)左右(吕勇等, 2013)，D.D.较小时由于1 559 cm-1 酰胺Ⅱ谱带信号强烈掩蔽了较弱的氨基变形谱带，当D.D.增大70%时氨基变形谱带才表现出来(1 593 cm-1 )，并随着D.D.的不断提高，吸收峰出现在1 599 cm-1 处，如出现1 590 cm-1左右的谱带，可以认为该D.D.值在70%以上(董炎明等, 2001)。图6显示，在波长1 649.38 cm-1，1 598.56 cm-1，1 319.12 cm-1三处有吸收峰，说明本法制备产物为壳聚糖；图中显示三处特征峰谱非常微弱，原因是随着 D.D.升高，乙酰氨基含量减少所造成，说明本法制备的壳聚糖具有较高的D.D.，从红外光谱角度证实了CDA酶法能制备高 D.D.壳聚糖。

1.5微波辅助CDA酶法制备壳聚糖的效果分析

表2可以看出，微波辅助酶法制备的壳聚糖所需时间为5 h，黏度为96.8 mPa·s，D.D.为 93.12%，相对得率为87.74%，本法制备的龙虾壳聚糖的D.D.、黏度、制备时间和相对得率明显高于传统热碱法、单一超声法，具有操作时间短，高脱乙酰度，高黏度的优点，整个过程中不使用任何强酸强碱，无任何环境污 染，因此本法将具有很大的市场推广价值。

2 讨论

本研究在预试验基础上，通过单因素分析和正 交试验分析，确定以烹饪后淡水小龙虾壳为原料，虾 壳经乙醇浸泡、微波辐射预处理后，采用 CDA 酶法 脱乙酰基制备小龙壳聚糖的最佳工艺条件为：80% 乙醇浸泡 2 h，在微波功率 550 W 下处理 6 min，加酶 量 10%、酶解时间 3 h、酶解温度 45℃，在此制备工 艺下，脱乙酰度高达 93.12%、黏度 96.8 mPa·s，相对 得率 87.74%，产品为白色粉末，其性质稳定、纯度 高，可用于制备壳聚糖功能性材料、食品、医药等领域。本研究成果有利于小龙虾废弃资源综合利用，减少资源浪费和环境污染。本法以烹饪后小龙虾加工虾壳为原料，通过EDTA法提取甲壳素后，再以此甲壳素为原料，利用微波辐射和乙醇作用破坏甲壳素分子内部H键，利用酶的高效催化及专一性对其进 行脱乙酰作用，制备了高D.D.、高粘度的壳聚糖。与常用方法相比，本法不再使用强碱脱乙酰基，且使用的EDTA可100%回收，具有制备时间短、产品脱乙 酰度高、纯度高、性质稳定等优势，因此该法为环境清洁型的工业化壳聚糖生产奠定基础，顺应了未来经济发展趋势。

3材料与方法

3.1主要材料与试剂

烹饪后淡水小龙虾壳，采集于某龙虾馆；乙二胺四乙酸钠、双氧水等试剂购于南京化学试剂股份有限公司，AR；甲壳素脱乙酰基酶粗酶液(本实验室自制)。

3.2 主要仪器

仪器：傅立叶变换红外光谱仪(FTIR-8400S, 日本岛津)、手提式高速粉碎机(CE-500,浙江屹立工贸有限公司)、数控加热超声清洗机(SCQ-6201E,上海声彦 超声波仪器有限公司)、电热恒温干燥箱(SCQ-GC26,上海声彦超声波仪器有限公司)、微波炉(MKJ-J1-4, 青岛迈可威微波应用技术有限公司)、数显恒温水浴锅(HH-8, 南京宝都仪器有限公司)、粘度计(NDJ-8S,上海慧可实验仪器有限公司)。

3.3试验方法

3.3.1微波辅助

CDA酶法制备工艺样品预处理→EDTA超声处理→过滤干燥→脱色→水洗至中性→烘干→乙醇浸泡→过滤→水洗→ 微波处理→CDA酶法脱乙酰→过滤→水洗至中性→烘干→壳聚糖。

3.3.2技术要点

3.3.2.1烹饪后小龙虾壳样品预处理洗净烹饪后小龙虾壳，以无水乙醚中洗涤 4~6次，再以无水乙醇抽提4~6 次，再用蒸馏水洗净后过滤，滤渣于60℃烘箱中烘干，粉碎机粉碎至过 830 μm目筛，备用。3.3.2.2超声波辅助EDTA法提取甲壳素称取一定量经前处理后的小龙虾壳粉末于烧杯中，按料液比1:24 (m/V)的量，加入pH=13的18%的EDTA溶液，置于超声频率60 KHz，功率180 W，温度35℃的超声波清洗器中，搅拌反应45 min，过滤并以蒸馏水洗涤滤渣，收集上述滤渣，于50℃烘干。再以10%的过氧化氢溶液在35℃水浴中浸泡，脱色2 h，洗净烘干后的白色粉末即为甲壳素(莫祺红等, 2009)。

3.3.2.3 CDA酶法脱乙酰基

已制备好的龙虾壳甲壳素粉碎至过180 μm目筛，按料液比1:20 (m/V)加入80%乙醇溶液，浸泡2 h后，置于功率为550 W的微波炉中，微波预处理一定时间后，冷却至室温；加入一定量的酶活约200 U/mL的CDA 粗酶液，一定温度下恒温搅拌酶解，酶解时以氢氧化钠调pH为酶反应最适pH7.5，反应完全后，采用100℃水浴灭酶活15 min，迅速冷却至室温，2 000r/min 离心20 min，蒸馏水洗涤至中性，过滤得沉淀，烘干后得龙虾壳聚糖(刘振春等, 2014)。

3.3.3相关指标测定及酶活定义

脱乙酰度(D.D.)、粘度测定、壳聚糖得率计算及酶活定义参考文献(窦勇和胡佩红,2014)方法进行。

3.3.4龙虾壳聚糖红外光谱表征将制备的壳聚糖产品研磨成粉末，与KBr粉末压片后，采用傅立叶变换红外光谱仪扫描，扫描范围400~4 000 cm-1，分析其特征谱峰与脱乙酰作用关系。

3.3.5碱法制备龙虾壳聚糖采用文献(周安娜等, 2003)壳聚糖制备方法。

3.3.6超声波法制备淡水小龙虾壳聚糖

准确称取自制龙虾壳甲壳素约10 g于80 mL 50% NaOH 溶液中，在超声频率40 KHz，超声功率为400 W 条件下，超声波处理60 min后，反应温度设置为85℃，恒温搅拌反应8 h后，冷却至室温，经多次过滤和蒸馏水洗涤至中性，滤渣烘干即得小龙虾壳聚糖。

3.3.7微波辅助酶法制备烹饪后小龙虾壳聚糖单因素试验(Cardoso et al., 2001; 曹健等, 2005; 李巧霞, 2006)

根据预试验，确定微波功率、微波时间、加酶量、酶解温度、酶解时间对壳聚糖D.D.影响较大，故对此五因素进行单因素试验，设置不同梯度条件：微波功率100 W、250 W、400 W、550 W、700 W、900 W；微波时间 2 min、5 min、8 min、11 min、14 min、17 min；加酶量(粗酶液体积与底物甲壳素质量之比, v/w) 1%、 5%、9%、13%、17%、21%；酶解时间1 h、2 h、3 h、4 h、 5 h、6 h；酶解温度20℃、30℃、40℃、50℃、60℃、 70℃；按3.3.1法制备壳聚糖，并测定D.D.值和粘度， 选择各单因素最佳条件。

3.3.8 正交试验

选取微波时间、酶反应时间、酶反应温度和加酶量四个对脱乙酰度值影响较大因素设计正交试验，选择脱乙酰度较大的反应条件为最佳条件，见表3， 其他因素水平以3.3.7确定的最佳水平，进行试验。

作者贡献

窦勇和顾鹏程负责实验的设计和文章审核；沈媛媛和胡佩红负责实验的具体实施。

致谢

感谢江苏省淮安市科技局科技支撑计划农业项目(SN1174)提供的资助。

参考文献

Cao J., Dai Y.Y., Wang H.J., and Wang Y.J., 2005, Research on chitosan preparation by microwave deacetylation of chitin, Shipin Kexue (Food Science), 26(11): 120-125 (曹健, 代养勇,王红军, 王育军, 2005, 甲壳素微波法脱乙酰制备壳聚 糖的研究, 食品科学, 26(11): 120-125)

Cardoso M.B., Signini R., and Campana-Filho S.P., 2001, On the sonication of chitin: effects on its structure and morphology and influence on its deacetylation, Polymer Bulletin, (47): 183-190

Dong Y.M., Wang M., Wu Y.S., and Ruan Y.H., 2001, FTIR spectroscopic determinations of chitosan derivatives, Xian weisu Kexue Yu Jishu (Journal of Cellulose Science and Technology), 9(2): 42-56 (董炎明, 王勉, 吴玉松, 阮永红, 2001, 壳聚糖衍生物的红外光谱分析, 纤维素科学与技术, 9(2): 42-56)

Dou Y., and Hu P.H., 2014, Ultrasound-assisted CDA enzymatic method for preparation of freshwater crayfish shell chitosan, Shipin Yu Fajiao Gongye (Food and Fermentation Industry), 40(11): 127-131 (窦勇, 胡佩红, 2014, 超声协同 CDA 酶法制备龙虾壳聚糖, 食品与发酵工业, 40(11): 127-131)

Ji J.L., Tang L.X., and Qian Q.H., 2013, Process optimization of the extraction of chitin and preparation of chitosan from prawn shells, Shipin Keji (Food Science and Technology), 38 (4): 200-209 (季锦林, 汤立新, 钱清华, 2013, 间歇法提取虾甲壳素和制备壳聚糖的工艺优化, 食品科技, 38 (4): 200-209)

Li Q.X., Song B.Z., Yang Z.Q., and Fan H.L., 2006, Preparation of chitosan with high viscosity-average molecular weight and high degree of deacetylation by rapid interim microwave heating method, The chinese journal of process engineering, 6(5): 789-793 (李巧霞, 宋宝珍, 仰振球, 樊红雷, 2006, 微波间歇法快速制备高粘均分子量和高脱乙酰度的壳聚糖, 过程工程学报, 6(5): 789-793)

Liu Z.C., Han Y., Sun H.J., and Geng C.H., 2014, Preparation of ACE inhibitory peptides from mung been using ultrasonic-assisted enzymatic method, Xibei Nonglin Kejidaxue Xuebao (Zirankexue Ban) (Journal of North west A & F University (Nat.Sci.Ed.)), 42 (8): 1-8 (刘振春, 韩宇, 孙慧 娟, 耿存花, 2014, 超声波辅助酶法制备绿豆 ACE 抑制肽 的工艺研究, 西北农林科技大学学报(自然科学版), 42(8): 1-8)

Lv Y., Song C., Long Z., and Dai L., 2013, Preparation of chitosan with different degree of deacetylation value and packaging performance of its coated, Baozhuang Gongcheng (Journal of Packaging Engineering), 34(11): 1-4 (吕勇, 宋词, 龙柱, 戴磊, 2013, 不同脱乙酰度壳聚糖制备及涂布纸包 装性能研究, 包装工程, 34(11): 1-4)

Mo Q.H., Lu J., Huang P.F., Yan Y.X., and Su G.J., 2009, Chitosan preparation by deacetylation of chitin under ultrasonic pretreatment Food Science and Technology, Shipin Keji (Food Science and Technology), 34(8): 200-209 (莫祺红, 卢 洁, 黄佩芳, 阎欲晓, 粟桂娇, 2009, 超声波预处理脱乙酰 化制备壳聚糖的研究, 食品科技, 34(8): 200-209)

Pareek N., Vivekanand V., and Singh R. P., 2013, Chitin deacetylase: characteristic molecular features and functional aspects, In: Advances in enzyme biotechnology, Springer India, India, pp.125-136

Sila A., Mlaik N., Sayari N., Balt R., and Bougatef A., 2014, Chitin and chitosan extracted from shrimp waste using fish proteases aided process: efficiency of chitosan in the of treatment unhairing effluents, J. Polym. Environ., 22: 78-87

Zhao Y.E., and Jin D., 2015, Chitosan composites for bone tissue engineering application, Jiyinzuxue Yu Yingyong Shengwuxue (Genomics and Applied Biology), 34(4): 82-848 (赵易 尔, 金丹, 2015, 壳聚糖复合材料在骨组织工程中的应用, 基因组学与应用生物学, 34(4): 842-848)

Zhou A.N., Zhang G.D., and Zhang W.Y., 2003, The new preparation technology of one-step chitosan, Shipin Gongye Keji (Science and Technology of Food Industry), 24 (1): 73-75 (周安娜, 张国栋, 张文艺, “一步法”壳聚糖制备新工艺, 食品工业科技, 24(1): 73-75)